Resultados da qPCR no limite de detecção
A qPCR (Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real) é uma técnica altamente acurada e robusta. No entanto, como em todo método analítico, há uma “faixa cinzenta” próxima do limite de sensibilidade analítica (“borderline”), que na qPCR é estreita e caracterizada por CTs “elevados” e amplificações intermitentes.
Vale lembrar que a qPCR se baseia na medição de fluorescência, relacionando-a à concentração do material amplificado. Em amostras com baixa carga, a detecção é mais tardia, com limitações técnicas intrínsecas. Há sinais considerados ruídos (“background”) concomitantes à amplificação específica, de menor intensidade. Daí, surge o questionamento aos resultados reportados.
O propósito deste texto é oferecer parâmetros, com orientações que permitam ao analista atribuir resultados com maior confiança nesta faixa, conforme segue:
- Controles analíticos - Se não houver conformidade, considere repetir a análise. Avalie o sinal produzido pela curva da amostra, comparando-a com a dos controles negativos de amplificação. Se houver semelhança, é possível que o sinal seja apenas ruído, ou seja, um resultado negativo.
- Valores de CT - Alíquotas de amostras com cargas extremamente baixas, com menos de 10 cópias de DNA ou RNA, geralmente resultam em CTs superiores a 35. Considere que, na equação matemática da PCR, a amplificação de uma única cópia de DNA gera uma curva de amplificação com CT máximo de 37 (com pequenas variações neste valor, conforme se defina o Threshold). Pode-se até usar este valor como ponto de corte, a partir do qual cada resultado reportado exige extrema cautela.
- Confirmação ou correção de Baseline e Threshold - Com frequência, o ajuste automático destes parâmetros representa distorções. Se o Threshold não estiver na fase exponencial da curva de amplificação, mas no platô, por exemplo, ele deve ser corrigido. O baseline deve ser bem posicionado (a otimização destes parâmetros será oportunamente detalhada em publicações futuras).
- A análise do multicomponent (o nome pode variar conforme o fabricante do termociclador) - Este gráfico exibe a contribuição espectral completa do fluoróforo ao longo de todos os ciclos da PCR. Mostra os dados “brutos”, mais facilmente interpretáveis, pois o software do termociclador aplica filtros, compensações, eliminação de ruídos e algoritmos de suavização. Em algumas circunstâncias, estes tratamentos podem levar a conclusões equivocadas, como as originadas pela degradação da sonda durante a reação, por exemplo. Para amostras com CT no limiar de detecção sugere-se comparar o multicomponent da amostra com o dos controles negativos. Se apresentarem padrão semelhante, é possível que a amostra seja negativa.
Estas orientações ajudam a reduzir a incerteza associada à interpretação dos resultados da “faixa cinzenta” de CTs bastante elevados. Vale lembrar que boa parte destes cuidados não se restringe às amostras no limite de sensibilidade, mas a todas analisadas.
Caso persistam dúvidas, quando possível, é recomendado indicar nova coleta da amostra e reforçar o monitoramento de sinais clínicos do lote em questão. Veja conteúdo adicional em simbios.com.br/interpretacao-dos-resultados-191
É essencial que o laboratório mantenha a confiança nos resultados, fundamental na garantia de qualidade dos serviços.
