Matrizes biológicas e inibidores: como a fase pré-analítica afeta o diagnóstico por PCR
A confiabilidade dos resultados de PCR depende de cuidados que começam muito antes da análise laboratorial, ainda na fase pré-analítica. É o momento de definição do tipo de amostra mais adequado e da instalação de boas práticas de conservação e transporte.
Embora a PCR seja uma técnica altamente sensível e robusta, a presença de substâncias interferentes na matriz biológica pode alterar a cinética da reação, reduzir a eficiência de amplificação e levar a resultados falsos-negativos. Contudo, a presença de um potencial inibidor não inviabiliza automaticamente o diagnóstico. A escolha do espécime deve ponderar o sítio de infecção, o patógeno investigado e as estratégias disponíveis para mitigar essas interferências.
Abaixo, destacamos alguns dos principais fatores que demandam atenção na fase pré-analítica:
Sangue total com heparina: a heparina é um potente inibidor da Taq polimerase e da transcriptase reversa (RT), podendo bloquear a reação mesmo em concentrações residuais. Para análises moleculares, deve-se priorizar o EDTA, que preserva os ácidos nucleicos e apresenta boa compatibilidade com a PCR nas concentrações adequadas.
Sangue intensamente hemolisado: a hemólise libera hemoglobina e heme, componentes que podem inibir as polimerases e comprometer a amplificação. Amostras com hemólise acentuada devem ser evitadas ou submetidas a procedimentos de extração apropriados com essa condição.
Urina com alta concentração de ureia: a ureia pode interferir na atividade das enzimas da reação. Em amostras mal conservadas ou armazenadas por longos períodos, alterações químicas podem comprometer também a integridade dos ácidos nucleicos. Recomenda-se processamento rápido e conservação adequada.
Fezes e conteúdo intestinal: contém polissacarídeos, ácidos biliares, bilirrubina e outros compostos que podem dificultar a extração e inibir a amplificação. Apesar disso, são a principal ou única matriz para determinados patógenos entéricos. O uso de métodos de extração específicos e diluição adequada podem minimizar esses efeitos.
Solo rico em ácidos húmicos: compostos húmicos podem se associar ao DNA e interferir na atividade da polimerase. Essas matrizes exigem métodos de extração específicos, com etapas destinadas à remoção desses interferentes.
Tecidos fixados em formalina e parafinados (FFPE): a fixação pode causar ligações cruzadas, fragmentação e modificações químicas dos ácidos nucleicos. Embora possam ser analisados, exigem protocolos específicos, como desparafinização e reversão de cross-linking.
Fenol residual: resíduos de fenol provenientes de extrações com fenol-clorofórmio podem inibir ou desnaturar as enzimas da reação. Amostras submetidas a esse procedimento devem passar por purificação adequada antes da PCR.
Cama aviária: matriz ambiental complexa de alta representatividade epidemiológica, mas desafiadora para PCR. Sua degradação acumula ácidos húmicos, amônia, lipídios e minerais que inibem a Taq polimerase e a RT. Para viabilizar a análise, exige protocolo pré-analítico adequado para extração de DNA/RNA.
A qualidade do diagnóstico molecular começa antes da chegada da amostra ao laboratório. Diante de uma matriz complexa ou potencialmente problemática, a melhor estratégia é alinhar os procedimentos de coleta ou buscar amostras alternativas que garantam maior confiabilidade ao teste. A comunicação prévia entre o solicitante e a equipe técnica é fundamental para prevenir resultados inconclusivos e falsos-negativos.
A equipe da Simbios está à disposição através de seus canais oficiais para orientar sobre os melhores protocolos de coleta, conservação e envio de amostras para o diagnóstico molecular.
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