Controles internos em qPCR: qualidade e confiabilidade diagnóstica
A utilização de kits de qPCR contendo Controles Internos de Amplificação (CIAs) representa uma boa estratégia na prática diagnóstica. Eles são utilizados para confirmar a boa qualidade e confiabilidade da qPCR, sendo úteis na identificação de resultados falso-negativos ou de variações dos valores esperados de Ct (Cycle threshold ou carga). A amplificação bem sucedida dos CIAs fornece ao laboratório a confiança de que o procedimento analítico detecta corretamente o patógeno, quando ele está presente na amostra.
Como funciona um mastermix com CIA?
A qPCR com CIA consiste tipicamente em uma reação multiplex, composta pelo alvo de interesse e por uma sequência sintética de DNA que idealmente não possui homologia com nenhum organismo conhecido, que servirá como controle interno de amplificação. Estes dois alvos são detectados simultaneamente na mesma reação utilizando sondas com fluoróforos distintos, o que permite a clara diferenciação das curvas de amplificação no software de qPCR. Um sinal positivo de CIA em uma amostra que apresenta resultado negativo para o alvo indica que o ensaio foi realizado corretamente e que o resultado negativo é provavelmente verdadeiro. Por outro lado, a ausência do sinal do controle interno (juntamente com um sinal negativo para o alvo de interesse) levanta a suspeita, sugerindo problema com a reação que deve ser investigado, evitando-se a liberação de um resultado falso-negativo:
* A ausência de amplificação no CIA pode ocorrer quando o alvo de interesse está presente, principalmente em alta concentração.
** Indica problema na qPCR.
Desvios significativos nos resultados podem indicar:
a presença de inibidores de qPCR,
problemas nos reagentes (como mastermix e enzimas) ou
falhas de preparo da qPCR, como problemas na pipetagem ou falta de enzima.
Utilização do CIA para monitorar a qualidade do laboratório
O CIA é adicionado em concentração única e constante, permitindo que seu valor de Ct constitua referência fixa, contribuindo significativamente para o sistema de garantia de qualidade ao possibilitar o monitoramento contínuo da consistência dos resultados. A análise das variações nos valores de Ct do CIA, segundo critérios estabelecidos pelo sistema de gestão da qualidade do laboratório, permite a identificação precoce de desvios ou inconsistências. Essa prática facilita a implementação imediata de ações corretivas, assegurando a precisão e a confiabilidade dos dados obtidos por qPCR.
Atualmente, a Simbios Biotecnologia disponibiliza três produtos da linha NewGene que possuem controles internos de amplificação: os kits NewGene SAL+Amp, NewGene MG+Amp e NewGene MS+Amp. Confira aqui.
Veja também:
LANÇAMENTO | NewGene MG+Amp - Controle de qualidade em cada reação
