BOAS PRÁTICAS EM PCR | Prevenção de contaminação cruzada por amplicons
A técnica de PCR é altamente sensível. Por meio dela, bilhões de cópias de DNA ou RNA (amplicons) podem ser produzidas a partir da amplificação de poucas sequências-alvo. No entanto, se estes amplicons não forem contidos, podem contaminar as superfícies do laboratório e, nas próximas reações de PCR, podem levar à amplificação deste “DNA intruso”. As consequências são bastante danosas, incluindo resultados falso-positivos, perda de tempo para investigação e descontaminação, além de perda de credibilidade.
A implementação de boas práticas e medidas de contenção geralmente são suficientes para evitar dissabores, minimizando consideravelmente os riscos. De maneira resumida, destacamos as principais condutas:
Infraestrutura: o laboratório deve ter áreas dedicadas, previstas no projeto de instalação. O ideal são duas salas separadas: pré-PCR (sala limpa) para preparação de amostras, extração do DNA/RNA e preparo das reações; e outra pós-PCR (sala suja) com termociclador.
Consumíveis e equipamentos dedicados: cada ambiente (salas suja e limpa) deve conter seu próprio conjunto de equipamentos e utensílios (como pipetas, centrífugas, freezer, geladeira, jalecos) e de consumíveis (como ponteiras e tubos plásticos). Luvas devem ser trocadas a cada procedimento.
Fluxo unidirecional: os processos devem ocorrer em direção única (Pré-PCR > Pós-PCR). Não deve haver movimento de consumíveis, equipamentos e pessoas das salas sujas para salas limpas.
Boas técnicas de pipetagem: a posição, o ângulo, velocidade e pressão corretas evitam aerossóis e respingos.
Uso de ponteiras com barreira: evita que aerossóis entrem em contato com a pipeta e depois sejam transferidas às amostras.
Uso de controles negativos: com todos os reagentes da reação de PCR, exceto o template (amostra extraída). Permitem a identificação de contaminação em amostras, reagentes e/ou ambientes do laboratório.
Limpeza de superfícies: deve ocorrer com frequência (com o uso de hipoclorito de sódio e álcool).
Opção por método PCR em tempo real (qPCR): utiliza tubo fechado, a ser descartado após a ciclagem e coleta de dados sem ser aberto, evitando exposição dos amplicons.
As boas práticas previnem a contaminação e suas consequências e devem ser priorizadas nas rotinas dos laboratórios de biologia molecular. Confira neste vídeo o compilado deste conteúdo em imagens.
