Qualidade dos resultados de qPCR no ajuste de threshold
Como abordado anteriormente em nossos canais digitais, a acurácia nos resultados de qPCR (Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real) requer cuidados no ajuste da curva de amplificação, permitindo a correta interpretação de resultados, mesmo no ‘borderline’.
Dois parâmetros desempenham papel crucial nesse processo: o threshold e o baseline (clique aqui para acessar). O primeiro, foco de nossa abordagem, refere-se ao valor de fluorescência que, quando ultrapassa determinado nível, em intersecção com a curva de amplificação, define o denominado Cycle Threshold (CT). O CT corresponde ao número de ciclos a partir do qual a amplificação da sequência alvo de DNA é detectada (Kubista et al., 2006). Como princípio fundamental, o threshold é posicionado no meio da porção exponencial da curva de amplificação, após o baseline (ruído de fundo), e antes da fase de platô. Pode ser escolhido manual ou automaticamente. E, dependendo do software utilizado, o gráfico de amplificação pode ser mostrado de duas formas, de acordo com a escala do eixo Y: linear ou logarítmica. A melhor maneira de se definir o limite manual é usar a escala logarítmica, pois proporciona uma ampliação visual da fase exponencial, evidenciada como uma "reta".
Da mesma forma que ocorre com o baseline, para o qual o ajuste automático pode levar a resultados duvidosos ou imprecisos, é recomendado realizar rotineiramente o ajuste manual de threshold, evitando-se o automático.
Ajuste de threshold e determinação do valor de CT:
1) Com o baseline já definido, analise todas as curvas de amplificação para identificar a fase de platô e os pontos onde ocorrem sinais de ruído de fundo.
2) Defina o threshold na fase exponencial da amplificação, preferencialmente no ponto médio (no meio da fase exponencial), entre o ruído de fundo e a fase de platô.
3) Verifique se alguma amplificação parece estar em declínio sem ultrapassar o threshold ou se foi posicionado na fase do platô. Se necessário, faça ajustes cuidadosos para incluir a curva “atípica”, assegurando que todas as outras permaneçam na fase exponencial.
Nunca ceda à tentação de 'forçar’ o threshold para atingir um determinado CT. A manipulação arbitrária pode distorcer e comprometer a integridade do conjunto das análises. É importante saber que o CT é um valor relativo e, embora seja um ponto de referência bastante útil, pode variar entre diferentes análises.
Se surgirem dúvidas ou se desejar obter mais informações sobre o assunto, ficaremos satisfeitos em receber sua mensagem. Nossa equipe técnica está sempre à disposição para auxiliá-lo!
Referências:
Kubista, M., Andrade, J. M., Bengtsson, M., Forootan, A., Jonák, J., Lind, K., ... & Zoric, N. (2006). The real-time polymerase chain reaction. Molecular aspects of medicine, 27(2-3), 95-125.
Archer, B. G. (2017). Note on the PCR threshold standard curve. BMC Research Notes, 10(1), 1-4.
