Parâmetros de validação de métodos (Parte 1)
Como apresentado anteriormente, embora a PCR seja amplamente reconhecida por sua alta sensibilidade, especificidade e robustez, sendo considerada o padrão ouro entre os métodos laboratoriais, sua aplicação, como qualquer técnica analítica, exige validação criteriosa para assegurar a confiabilidade dos resultados e a adequação ao objetivo proposto.
Embora os métodos analíticos tradicionais, especialmente os de base química, sigam diretrizes de validação bem estabelecidas, ensaios moleculares como a PCR apresentam particularidades que incorporam desafios adicionais. Entre eles estão a sensibilidade a variáveis biológicas e enzimáticas, bem como a dinâmica da amplificação exponencial. A escassez de normas específicas para métodos moleculares e a adaptação de guias de base química contribuem para dúvidas na condução da validação.
Este artigo e sua continuação, a ser apresentada em breve em nova publicação, abordará os principais parâmetros para a validação de PCR, destacando seu significado e importância para garantir a padronização, a confiabilidade e a aplicabilidade dos ensaios.
• Especificidade analítica: capacidade do método em detectar exclusivamente o alvo de interesse, sem amplificação de sequências indesejáveis. É avaliada por meio de painéis com outras espécies e por análises in silico, visando evitar reações cruzadas.
• Sensibilidade analítica: menor quantidade de material genético que o método é capaz de detectar com confiabilidade, sendo comumente usada como sinônimo de limite de detecção (LoD). Sua estimativa é obtida por meio de diluições seriadas, determinando a menor concentração detectável com, em geral, 95% de probabilidade.
• Robustez: capacidade do método de manter seu desempenho sob pequenas variações nas condições laboratoriais. Ensaios fatoriais com alterações controladas permitem identificar variáveis críticas que influenciam o desempenho do teste.
• Precisão: grau de concordância entre resultados obtidos sob diferentes condições. Pode ser avaliada em três níveis: repetibilidade, quando as análises são feitas com a mesma amostra e em condições idênticas; precisão intermediária, que considera variações entre operadores, equipamentos ou dias; e reprodutibilidade, definida por alguns autores como a consistência dos resultados entre diferentes laboratórios.
A validação de métodos de PCR exige a avaliação criteriosa de diversos parâmetros para assegurar a confiabilidade dos resultados. A aplicação adequada desses critérios é essencial para a geração de dados robustos. No próximo texto, serão abordados outros parâmetros recomendados para a implementação e documentação da validação de métodos por PCR. Acompanhe nossa série de textos e conte com a expertise da Simbios Biotecnologia para apoiar a condução de validações em PCR.
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