A importância do bom ajuste de baseline na qualidade dos resultados de qPCR
Para alcançar resultados de qPCR com a máxima acurácia é necessário um bom ajuste da curva de amplificação. Dois parâmetros são importantes nesse processo: baseline (linha de base) e threshold. Neste texto, exploraremos o ajuste de baseline e, mais adiante, o do threshold.
Os equipamentos possuem uma função de ajuste automático. Mas será que isso resolve tudo? A resposta é não. Apesar de conveniente, frequentemente o software de análise realiza um mau ajuste no baseline e threshold, com resultados fora das especificações, gerando curvas sem o típico formato sigmoidal de uma boa amplificação. Isto pode levar a diagnósticos duvidosos ou imprecisos, especialmente na “faixa cinzenta” próxima do limite de sensibilidade analítica (“borderline”), como já foi discutido em um artigo anterior. Até mesmo falsos-positivos podem ocorrer se o ajuste automático confundir oscilações no baseline com curvas de amplificação.
É fundamental adotar a prática de examinar cuidadosamente as curvas e resultados de todas as amostras e controles, realizando ajustes conforme necessário. Se possível, recomenda-se realizar estes ajustes de forma manual como procedimento padrão, evitando o ajuste automático.
Remoção do sinal ruído através do ajuste de Baseline
O baseline refere-se à fluorescência de fundo, ou ruído, identificada nos estágios iniciais da qPCR (em geral, entre três e 15 ciclos), nas quais não se alcança a capacidade de detecção do termociclador. Nesta fase, tudo o que o equipamento registra é caracterizado por linhas irregulares, com muitas variações de baixa intensidade, o que deve ser excluído da análise, justamente através do ajuste de baseline. Ele consiste em identificar o início e o final deste ruído, excluindo este intervalo, de forma a priorizar as leituras subsequentes, livres destas variações.
Para isto, siga os passos abaixo:
- Verifique se nas curvas de amplificação da leva de análises existe alguma oscilação a ser excluída.
- Defina o final do intervalo de todas as amostras da corrida, visualizando os dados de fluorescência na escala linear do gráfico de amplificação, e identifique a amostra com a primeira curva de amplificação válida (de menor CT). O baseline end deve ser ajustado em, no máximo, 3 a 5 CTs antes deste ponto.
- Defina o início do intervalo no começo da PCR, pouca fluorescência é gerada, então defina esse valor no mínimo no ciclo 3 ou no primeiro ponto de estabilidade do sinal. Alternativamente, pode-se fixar o ciclo 3 como referência.
- Confira se o ajuste efetuado resulta em curvas de amplificação com o formato e qualidade desejados. Se necessário, repita o ajuste com outro intervalo.
Resumindo, um ajuste cuidadoso do baseline da qPCR constitui-se numa habilidade essencial do analista de laboratório, elevando a precisão e a acurácia, o que garante a confiabilidade dos resultados.
Referências:
Ruijter, J. M., Ramakers, C., Hoogaars, W. M. H., Karlen, Y., Bakker, O., Van den Hoff, M. J. B., & Moorman, A. (2009). Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic acids research, 37(6), e45-e45.
